腺相關病毒載體包裝服務
關於腺相關病毒
腺相關病毒 (adeno-associated virus, AAV) 是當今臨床和生醫研究中最常用的病毒載體之一。與其他常用的慢病毒、腺病毒、反轉錄病毒和脂質載體相比，AAV 是唯一一種可同時具備長時間穩定表現、作用在多種器官組織並且不會引發強烈免疫反應的載體，而這也使得 AAV 成為了動物實驗與人類基因治療的首選載體之一。再者，AAV 具有相對較高的安全性，若不涉及特殊致病性基因的表達，可於生物安全一級 (BSL-1) 實驗室操作。在應用方面，AAV 可以與 shRNA、CRISPR-Cas、基因序列和 miRNA 等技術結合使用，從而實現對於單個甚至多個基因、miRNA 或 ncRNA 表現量的控制。此外，AAV 還可以用於表達一些蛋白質工具，以幫助進一步的研究。而 AAV 有不同的給予方式，除了可以直接在器官組織內局部注射外，也可透過靜脈注射全身性的給予並配合細胞類型專一性啟動子，以在特定器官組織內實現均勻且精確的基因表達控制。
技術平台目前提供 12 種血清型 (serotype) 的包裝服務，其中包括 AAV 1、2、5、6、8、9、rh10、DJ、PHP.S、PHP.eB、2-retro 和 BR1。
-
申請者只需提供 transfer plasmid，其上含有欲包裝至病毒內的序列。
-
技術平台可提供構建 transfer plasmid 的完整方法步驟。
服務項目
技術平台提供純化、未純化，以及不同病毒總量的選擇。| 應用 | 有效病毒總顆數 | 最低濃度 (200ul) | 所需質體量 (transfer plasmid) |
價格 | 製備時間 | |
| 病毒包裝 | 質體放大 | |||||
| 細胞實驗 (未純化) |
> 1 x 1012 vg | > 5 x 1012 vg/ml | 50 ug | $10,000 | $3,000 | 3 - 5 週內 |
| 細胞實驗、 動物實驗 (純化) |
> 2 x 1012 vg | > 1 x 1013 vg/ml | 70 ug | $15,000 | $3,000 | |
| > 5 x 1012 vg | > 2 x 1013 vg/ml | 150 ug | $19,000 | $4,000 | ||
| > 1 x 1013 vg | > 5 x 1013 vg/ml | 300 ug | $26,000 | $5,000 | ||
| 其它規格 | -- | 歡迎詢價 | -- | |||
-
以上規格皆可指定濃縮至 0.2 ~ 1 ml 體積，申請者需留意最終濃度 (vg/ml) 是否有達實驗需求。
- 質體請使用市售 Midi/Maxi/Mega kits 純化，以確保病毒品質。
應用資訊
器官組織偏好性
不同 AAV 血清型具有偏好進入不同器官、組織以及細胞類型的特性。
以下列出各個血清型的器官組織偏好性供為參考：
| AAV-1 | AAV-2 | AAV-5 | AAV-6 | AAV-8 | AAV-9 | AAV-rh10 | AAV-DJ | AAV-PHP.S | AAV-PHP.eB | AAV-BR1 | AAV-2-retro | |
| 中樞神經系統 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ||||
| 周邊神經系統 | ✽ | |||||||||||
| 視網膜 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | |||||
| 內耳 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ||||||||
| 心臟 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ||||
| 肺臟 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | |||||||
| 肝臟 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | |||||
| 腎臟 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ||||||||
| 胰臟 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | |||||||
| 脾臟 | ✽ | |||||||||||
| 睪丸 | ✽ | ✽ | ||||||||||
| 脂肪組織 | ✽ | ✽ | ||||||||||
| 平滑肌 | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | ✽ | |||||||
| 骨骼肌 | ✽ | ✽ | ||||||||||
| 腦血管內皮細胞 | ✽ |
-
AAV-PHP.eB 可以透過靜脈注射有效的通過血腦屏障，進入中樞神經系統。
-
AAV2-retro 能夠從神經元軸突進入細胞，逆行至細胞核並執行表達功能（如表達螢光蛋白），因此被廣泛應用於神經投射的逆向追蹤研究。
-
AAV-DJ 為融合了八種天然血清型序列的人工改造型，常用在體外細胞培養實驗上。
以 AAV9 血清型為例
圖為 8 週大的小鼠經由尾靜脈注射，全身性給予 5 x 1011 vg (⬢) 以及 1 x 1012 vg (⬢⬢) 帶有 CAG 啟動子與 GAPDH 基因的 AAV9，於四週後在四種器官組織表現 GAPDH 蛋白的 western blot 結果。而對照組 (⬡⬡) 為給予了 1 x 1012 vg 僅帶有 CAG 啟動子而無 GAPDH 基因的 AAV9。
參考工具
啟動子
選擇合適的啟動子 (promoter) 有助於減少對非目標細胞的影響。
以下列出一些具有組織細胞特異性的啟動子供為參考 (附文獻連結)：
| 細胞類型 | 啟動子 |
| Excitatory neuron | hSyn (0.5kb) / CaMKII (0.4kb) |
| Motor neuron | Hb9 (1.6kb) |
| Dopaminergic neuron | TH (2.5kb) |
| Glutamatergic neuron | PAG (2.4kb) |
| GABAergic neuron | GAD65 (2.5kb) |
| Neuronal activity | c-Fos (0.8kb) / eSARE (1kb) |
| Astrocyte | GFAP (gfaABC1D, 0.7kb) / ALDH1L1 (1.3kb) |
| Oligodendrocyte | MBP (1.9kb) / MAG (1.5kb) |
| Schwann cell | Mpz (1.2kb) |
| Microglia, Macrophage | F4/80 (0.7kb) |
| Retinal Muller cell | NR2E1 (Ple264, 2kb) |
| Retinal pigment epithelium | NA65p (0.8kb) |
| Brain endothelial cell | Ple261 (3kb) |
| Endothelial cell | Flt1 (1kb) |
| Cardiac muscle | cTnT (0.7kb) / aMHC (0.4kb) |
| Liver hepatocyte | TBG (0.8kb) |
| Kidney podocyte | NPHS1 (1.25kb) |
| Skeletal muscle | MCK (0.6kb) |
| Pancreas beta cell | RIP (0.6kb) |
| Pancreas acinar cell | Elastase I (0.3kb) |
| Pancreas alpha cell | GCG (0.7kb) |
| Osteoblast | Col1a1 (2.3kb) |
-
以 CaMKII 啟動子為例
圖為 8 週大的小鼠經由尾靜脈注射，全身性給予 1 x 1012 vg 帶有 CaMKII 啟動子與 eGFP 基因的 AAV-PHP.eB，於四週後在腦內特定類型的細胞表現 eGFP 的結果。
蛋白質工具
AAV 可用於表達一些蛋白質工具以協助研究。以下列出一些蛋白質工具供為參考：
| 功能特性 | 蛋白名稱 |
| Light-gated ion channel (optogenetics) | ChR2 / eNpHR / Arch / GtACR |
| Chemogenetics | Rq / hM3Dq / GsD / hM4Di / KORD |
| Recombinase for conditional knockout | Cre / Flp / Dre |
| Inducible gene expression system | TRE + rtTA (Tet-ON) / TRE + tTA (Tet-OFF) |
| DNA/RNA editing | CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 |
| Autophagic flux indicator | RFP-GFP-LC3 |
| Mitophagic flux indicator | mt-Keima / mito-QC / mito-SRAI |
| Mitochondrial labeling | MitoGFP / MitoRFP |
| Mitochondrial turnover indicator | MitoTimer |
| Apoptotic sensor (Caspase-3) | ECFP-DEVD-EYFP |
| Ca2+ sensor | GCaMP / Twitch / GECO / 4mtD3cpv |
| Voltage sensor | Volton / ArcLight / ASAP / Archon / Positron |
| pH sensor | SypHer / mito-SypHer / pHluorin |
| H2O2 sensor | HyPer / mito-HyPer |
| Neurotransmitter sensor | iSeroSNFR / iGluSnFR3 / iGABASnFR / iATPSnFR / dLight |
| Kinase activity sensor | AKAR / CKAR / EKAR / AKTAR / AMPKAR |
| Redox sensor | roGFP |
| Small GTPase activity sensor | G-Hras / G-Rac1 / G-Cdc42 |
| NADH/NAD ratio sensor | Peredox / SoNar / mt-SoNar |
| ATP/ADP ratio sensor | Perceval / PercevalHR |
生產資訊
Transfer Plasmid- 特性介紹
儘管 transfer plasmid 上的 ITRs 序列通常源自於 AAV2 血清型，但它們可以用來包裝進所有的 AAV 血清型中。
- ssAAV 與 scAAV
生產流程
- 製造與純化
當細胞生成病毒後，裂解的細胞以及含有病毒的培養基會先以 polyethylene glycol (PEG) 進行初步的蛋白質沈澱與收集，然後再透過碘克沙醇 (Iodixanol) 梯度離心分離 AAV 與其他蛋白質雜質。接著，從特定的碘克沙醇濃度層中抽取出純化的 AAV，再利用 100kDa MWCO 濃縮超濾管將碘克沙醇溶液替換為 PBS，同時將病毒濃縮至所需的濃度。
-
純化結果
圖為將技術平台純化後的 AAV 溶液， 經由 SDS 膠體電泳、轉漬以及 Coomassie blue 總體蛋白染色後的結果。顯示除了 AAV 外殼蛋白 VP1、VP2 以及 VP3 之外，沒有其它明顯蛋白質殘留。
- 定量